在众多可用的分析技术中，核磁共振波谱已被证明是研究血红蛋白最有价值的方法。不同极性溶剂稀释后，化学的变化，变温研究，二维HOESY和二维HSQC实验，清楚地确定了HB的存在或不存在。通过非共价键介导的1hJFH的检测也证明了尿素在HB中的参与据报道，被5个共价键（5 JFH）隔开的F和H之间的耦合总是小于1Hz。检测到¹⁹F和¹H之间显著大的偶联强度归因于HB介导。

在许多同核和异核自旋之间，如JHF、JFF、JPF和JPP，以及许多其他核磁共振活性核之间，有几个检测到直接通过空间耦合的例子，许多报告已经讨论了这种通过空间相互作用的机制和强度JFH的探测也有广泛的争论，它是由于氢键还是由于电子云的重叠而产生的。也有研究将这一术语归为“穿越空间”，并证明自旋极化可以通过氢键在H和F两个原子核之间传递。

邻苯甲酰氰胺衍生物具有重要的药理学意义，以抗菌、抗病毒、抗凝血剂等用途而闻名，也可作为人因子XA的有效抑制剂。因此，在苯甲酰环上通过邻位取代合成了一系列，其中一个H、一个供体（N）和两个H受体（O和x¼F）。满足分叉（三中心）分子内HB的要求（图1）。Surbhi Tiwari等人¹将所有这些分子都表征，并通过核磁共振实验的应用进行了研究，以确定HB的存在或不存在。分子的基本结构框架见图1。

图1 （a） N-苯甲酰氰胺及其衍生物的结构框架与HB中H原子的数目;（b）分叉HB可能形成的示意图。

一般来说，酰胺质子在¹ H核磁共振谱中共振在5-9 ppm之间，氢键的形成导致显著的不能下降。在该研究中，分子1的NH¹质子共振于12.22 ppm。NH¹质子与酰胺基羰基氧之间的分子内HB可能是该质子广泛脱屏蔽的原因。二维¹H – ¹H NOESY建立了两个自旋之间的空间接近性，有助于达到分子的有利构象。在分子1的NOESY光谱中检测到相关峰（图2），证实了NH¹和H¹⁷的质子在空间上的接近性。

图1 分子1在溶剂CDCl₃中298 K时的二维¹H - ¹H噪声光谱。

在分子2中，尿原子被认为与NH1参与了一个额外的分子内HB，导致了分岔。在二维¹⁹F - ¹H HOESY（异核Overhauser效应光谱）光谱中检测到¹⁹F和NH¹质子之间的强相关峰，加强了这一假设。因此，这些结果直接指向在所研究的系统中存在分叉HB。弱HB存在于N -甲酰基氰胺及其衍生物中，通过一、二维核磁共振实验研究得到了证实。二维NOESY（分子1）和二维HOESY（分子2）光谱中的强相关峰确定了NH¹和X （F或甲氧基）之间的空间接近，导致分叉HB的存在。

1.Tiwari, S.;  Arya, N.;  Mishra, S. K.; Suryaprakash, N., Competing HB acceptors: an extensive NMR investigations corroborated by single crystal XRD and DFT calculations. RSC Adv. 2021, 11 (25), 15195-15202.

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