自上个千年末以来，聚焦离子束扫描电子显微镜(FIB-SEM)逐渐在生物学研究中找到了用途。该仪器是一个带有镓离子柱的扫描电子显微镜，两束、电子和离子(FIB)聚焦在一个重合点上。其主要应用是获取三维数据，FIB-SEM层析成像。

 

  有了离子束，一些纳米的表面被移除，剩下的块面以重复的方式用电子束成像。该仪器还可以用来切割打开的生物结构以获得内部结构，或者制备薄层以用于(低温)透射电子显微镜成像。

 

  C. KIZILYAPRAK^[1]等人概述了FIB-SEM的发展，并讨论了有关样品制备和成像的几个问题。

 

  1974年，塞利格和弗莱明首次报道了聚焦离子束的实验，他们能够将一束硼离子聚焦到大约3.5微米。对许多不同的离子进行了测试，结果证明液态镓是最合适的。FIB技术的进一步发展是由日立高科技公司的石谷博士开创的。

 

  该仪器的主要应用是制备样品，制备薄片，用于缺陷分析的透射电子显微镜，特别是在半导体行业。后来，将FIB柱集成到扫描电子显微镜中。根据制造商的不同，它在52到55度的范围内以特定的角度倾斜。带有内置镓离子源的扫描电子显微镜称为聚焦离子束扫描电子显微镜，简称FIB-SEM。

 

  因此，样品可以用Ga⁺离子研磨，并在同一仪器中用电子成像，从而打开了FIB-SEM断层扫描和受控微加工的大门。

 

  第一批单光束仪器被用于半导体行业的缺陷分析。在确定的位置从晶片上切下一层薄片，将其变薄，然后用透射电子显微镜分析。

 

  随着FIB-SEM仪器的引入，电子束可以更好地监测这一过程。FIB-SEM的早期生物学应用是从超微切割机中难以或不可能用钻石刀切割的材料制备透射电子显微镜薄层。对于电子束，使用二次或背向散射电子，识别感兴趣的区域。

 

  然后，用离子束将该区域的薄片切割并转移到一个特殊的栅格上，在那里薄片上附着铂沉积。在栅极上，薄片在离子束中进一步变薄，直到它是电子透明的。网格从FIB-扫描电子显微镜转移到透射电子显微镜，以高分辨率分析薄层。

 

图1. FIB-SEM设置示意图。^[1]

 

  目前最有希望的技术是FIB-SEM断层扫描。从嵌入在树脂中的样品，在预选的感兴趣区域处打开树脂块表面的切割面。用离子束将薄至3 nm的薄片磨掉，然后用电子束对新生成的平面成像。通过重复该过程，生成被调查对象的3D数据集。

 

  利用这一过程，通常在所有三个维度的20-40微米范围内的体积都可以以低至3纳米的体素分辨率进行成像。

 

  到目前为止，FIBSEM断层扫描位于以下两者之间：在X，Y方向上的体积为2-5微米，在Z方向上为500 nm的TEM断层扫描，在大约1 nm的分辨率下，以及使用扫描电子显微镜中内置的微型切割器的连续分块面部断层扫描(SBF-SEM)，它在10-15 nm像素分辨率和大约30-50 nm Z分辨率下提供更大的体积。

 

图2. 在Helios 600 FIB-SEM上获得的肝脏显微照片。^[1]

 

  FIB-SEM断层扫描技术面临着一些挑战。首先，样品的制备必须适应扫描电子显微镜成像的要求，在不影响质量的情况下具有高对比度和导电性。细胞细节必须保存到仪器的分辨率水平。其次，必须开发检测系统，并找到允许更快采集的研磨和成像条件。

 

  最后但并非最不重要的一点是，需要开发能够区分和分割复杂灰值背景中的结构的自动分割软件。

 

  [1] KIZILYAPRAK, C., DARASPE, J. and HUMBEL, B.M. (2014), Focused ion beam scanning electron microscopy in biology. Journal of Microscopy, 254: 109-114.

 

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